艾滋病毒的基因疗法 艾滋病毒的编码基因

一、艾滋病毒的基因疗法

　　作为全球首例且唯一一名被（功能性）治愈的艾滋病患者，蒂莫西·雷·布朗（Timothy Ray Brown）也被称为“柏林病人”。2006年和2007年，布朗的主治医生两次使用一名具有CCR5突变基因（CCR5共受体是HIV进入细胞的另一道门，病毒不能与突变后的CCR5结合，也就无法进入细胞）的捐赠者的骨髓，不仅治好了布朗的白血病，也成就了艾滋病治疗史上的一段传奇。

　　“柏林病人使我们对基因突变和人体的免疫反应有了更深的认识，为我们打开了一扇新的门。”宾夕法尼亚大学的助理教授布鲁斯·莱文（Bruce Levine）说。受到布朗的启发，科学家开始思考，既然CCR5基因发生突变的细胞能抵御HIV的感染，又不失正常的免疫功能，那么，能否通过基因疗法，敲除患者细胞中的CCR5基因，使细胞对HIV产生抵抗力呢？桑加莫生物技术公司（Sangamo Biosciences）开发出的一种“基因剪刀”——锌指核酸酶（ZFN，一种人工改造的核酸内切酶，可在DNA特定位点进行定点剪切），使这些想法能够付诸实战。

　　目前，宾夕法尼亚大学阿博拉姆逊癌症中心的卡尔·朱恩（Carl June）团队和桑加莫公司联合研发的基因疗法SB-728-T，已经进入II期临床试验的末期，这也是第一次将基因编辑技术用在人类身上。研究人员从12名自愿者体内提取未被感染的辅助性T细胞，进行基因改造，敲除CCR5基因后，再向每位自愿者回注100亿个改造后的细胞。4周后，12名自愿者被分成两组，一组停止服用抗逆转录病毒药物12周，另一组继续服药。结果发现，停止服药的试验组中，有4名自愿者体内病毒数下降，其中一名自愿者甚至检测不到病毒。朱恩认为，“这项研究表明，我们能够安全有效地模仿自然发生的CCR5基因突变，改造后的辅助性T细胞能在感染者中断药物治疗后，持续控制病毒载量”。

　　不过，辅助性T细胞只能在病人身上存活数年，因此需要反复进行移植。如果能直接修改患者的干细胞基因，或许会是一种更理想的疗法。因为随着干细胞的增殖，人体就可以迅速建立一个能抵御HIV的全新的血液和免疫系统。

　　今年上半年，桑加莫公司已经与美国希望之城国家医学中心及南加利福尼亚大学凯克医学中心合作，开展干细胞基因疗法的研究。一项名为SB-728-HSPC的疗法已经进入临床试验，预计2016年完成I期临床试验。从桑加莫公司*上公布的日程来看，2020年将进入II期临床试验。

　　现在，艾滋病可能治愈，已逐渐成为艾滋病研究领域的共识。基因疗法或许将是治愈艾滋病的关键一步。

二、艾滋病毒的编码基因

　　病毒基因组是两条相同的正链RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。两端是长末端重复序列（long terminal repeats, LTR），含顺式调控序列，控制前病毒的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白，可分为三类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。

　　1．gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。

　　2．Pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。

　　3．env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120 V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应。

　　4．TaT 基因编码蛋白可与LTR结合，以增加病毒所有基因转录率，也能在转录后促进病毒mRNA的翻译。

　　5．Rev基因产物是一种顺式激活因子，能对env和gag中顺式作用抑制序列（Cis-Acting repression sequance,Crs） 去抑制作用，增强gag和env基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白。

　　6．Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用，以推迟病毒复制。该蛋白作用于HIv cDNA的LTR，抑制整合的病毒转录。可能是HIV在体内维持持续感集体所必需。

　　7．Vif基因对HIV并非必不可少，但可能影响游离HIV感染性、病毒体的产生和体内传播。

　　8．VPU基因为HIV-1所特有，对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少。

　　9．Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。

　　HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，但有一功能不明VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。

　　病毒特点　

　　主要攻击人体的辅助T淋巴细胞系统，一旦侵入机体细胞，病毒将会和细胞整合在一起终生难以消除；

　　广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液中，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高；

　　对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效；

　　感染者潜伏期长、死亡率高；

　　艾滋病病毒的基因组比已知任何一种病毒基因都复杂。

三、艾滋病毒的发展和现状

　　首次发现

　　艾滋病最早是于20世纪80年代初期在美国被识别，并受到当时里根保守政府的忽视。但在美国疾病控制与预防中心以及有识的医生与科学家的持续工作下，累积了信服性的流行病学数据，显示艾滋病有一定的传染性致因（etiology），同时，因药瘾者共用针具以及输血而感染的病例逐渐增多，许多科学家开始调查此传染性病原。

　　病毒命名

　　在巴黎巴斯德研究所专门研究逆转录病毒与癌症关系的法国病毒学家吕克·蒙塔尼（Luc Montagnier）及其研究组于1983年首次从一位罹患晚期卡波西氏肉瘤的年轻恋艾滋病人的血液及淋巴结样品中，分离到一种的新的逆转录病毒；他们发现这种病毒不同于人类T4淋巴细胞白血病病毒（Human T cell Leukemia Virus, HTLV），而是一种慢病毒（Lentivirus），他们将之命名为“免疫缺陷相关病毒”（Immune Deficiency-Associated Virus, ID*）。

　　大西洋另一边，蒙塔尼埃当时的合作者，美国国家癌症研究所的美国生物医学科学家罗伯特·加罗（Robert Gallo）及属下也从一些细胞株系中分离到新病毒，并将之命名为“IIIB/H9型人类T4淋巴细胞白血病病毒”（Human T cell Leukemia Virus-IIIB/H9, HTLV-IIIB/H9）；加罗小组首次于1984年在《科学》期刊发表论文，论证了这种新病毒与艾滋病的病原关系。

　　1986年，该病毒的名称被统一为“人类免疫缺陷病毒”（Human Immunodeficiency Virus, HIV），以更好地反映病毒导致免疫缺陷而不是导致癌症的性质。

　　病毒现状

　　在世界范围内导致了近1200万人的死亡，超过3000万人受到感染。

　　1986年7月25日，世界卫生组织（WHO）发布公报，国际病毒分类委员会会议决定，将艾滋病病毒改称为人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus），简称HIV。

　　在2004年，全球估计有3590至4430万人与人类免疫缺陷病毒相伴生存，其中430至640万人属于新发感染病例，另外，有280至350万人死于艾滋病。这些数字并在不断增长中，其中，东亚、东欧、中亚等地区涨幅最快。感染最严重的地区仍然是撒哈拉以南非洲，其次是南亚与东南亚。

四、艾滋病毒的感染方式有哪些

　　传播途径

　　HIV感染者是传染源，曾从血液、精液、阴道分泌液、乳汁等分离得HIV。握手，拥抱，接吻，游泳，蚊虫叮咬，共用餐具，咳嗽或打喷嚏，日常接触等不会传播。以下介绍主要三种传播方式：

　　性接触传播

　　HIV存在于感染者精液和阴道分泌物中，性行为很容易造成细微的皮肤粘膜破损，病毒即可通过破损处进入血液而感染。无论是同性还是异性之间的性接触都会导致艾滋病的传播。艾滋病感染者的精液或阴道分泌物中有大量的病毒，在性活动（包括阴道性交、*和*）时，由于性交部位的摩擦，很容易造成生殖器黏膜的细微破损，这时，病毒就会趁虚而入，进入未感染者的血液中。值得一提的是，由于直肠的肠壁较阴道壁更容易破损，所以肛门性交的危险性比阴道性交的危险性更大。

　　血液传播

　　人体被输入含有HIV的血液或血液制品、静脉*、移植感染者或病人的组织器官都有感染艾滋病的危险性。

　　母婴传播

　　感染了HIV的妇女在妊娠及分娩过程中，也可将病毒传给胎儿，感染的产妇还可通过母乳喂养将病毒传给吃奶的孩子。

　　致病机制

　　HIV选择性的侵犯带有CD4分子的，主要有T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等。细胞表面CD4分子是HIV受体，通过HIV囊膜蛋白gp120与细胞膜上CD4结合后，gp120构像改变使gp41暴露，同时gp120-CD4与靶细胞表面的趋化因子CXCR4或CXCR5结合形成CD4-gp120-CXCR4/CXCR5三分子复合物。gp41在其中起着桥的作用，利用自身的疏水作用介导病毒囊膜与细胞膜融合。最终造成细胞被破坏。其机制尚未完全清楚，可能通过以下方式起作用：

　　1．由于HIV包膜蛋白插入细胞或病毒出芽释放导致细胞膜通透性增加，产生渗透性溶解。

　　2．受染细胞内CD-gp120复合物与细胞器（如高尔基氏体等）的膜融合，使之溶解，导致感染细胞迅速死亡。

　　3．HIV感染时未整合的DNA积累，或对细胞蛋白的抑制，导致HIV杀伤细胞作用。

　　4．HIV感染细胞表达的gp120能与未感染细胞膜上的CD4结合，在gp41作用下融合形成多核巨细胞而溶解死亡。

　　5．HIV感染细胞膜病毒抗原与特异性抗体结合，通过激活补体或介导ADCC效应将细胞裂解。

　　6．HIV诱导自身免疫，如gp41与T4细胞膜上MHCⅡ类分子有一同源区，由抗gp41抗体可与这类淋巴细胞起交叉反应，导致细胞破坏。

　　7．细胞程序化死亡（programmed cell death ）：在艾滋病发病时可激活细胞凋亡 （Apoptosis） 。如HIV的gp120与CD4受体结合；直接激活受感染的细胞凋亡。甚至感染HIV的T细胞表达的囊膜抗原也可启动正常T细胞，通过细胞表面CD4分子交联间接地引起凋亡CD+4细胞的大量破坏，结果造成以T4细胞缺损为中心的严重免疫缺陷，患者主要表现：外周淋巴细胞减少，T4/T8比例配置，对植物血凝素和某些抗原的反应消失，迟发型变态反应下降，NK细胞、巨噬细胞活性减弱，IL2、γ干扰素等细胞因子合成减少。病程早期由于B细胞处于多克隆活化状态，患者血清中lg水平往往增高，随着疾病的进展，B细胞对各种抗原产生抗体的功能也直接和间接地受到影响。

　　艾滋病人由于免疫功能严重缺损，常合并严重的机会感染，常见的有细菌（鸟胞内分枝杆菌复合体，MAI）、原虫（卡氏肺囊虫、弓形体）、真菌（白色念珠菌、新型隐球菌）、病毒（巨细胞病毒、单纯疱疹病毒，乙型肝炎病毒），最后导致无法控制而死亡，另一些病例可发生Kaposis肉瘤或恶性淋巴瘤。此外，感染单核巨噬细胞中HIV呈低度增殖，不引起病变，但损害其免疫功能，可将病毒传播全身，引起间质肺炎和亚急性脑炎。

　　艾滋病病毒进入人体后，首先遭到巨噬细胞的吞噬，但艾滋病病毒很快改变了巨噬细胞内某些部位的酸性环境，创造了适合其生存的条件，并随即进入T－CD4淋巴细胞大量繁殖，最终使后一种免疫细胞遭到完全破坏。

　　HIV感染后可刺激机体生产囊膜蛋白（Gp120,Gp41）抗体和核心蛋白（P24）抗体。在HIV携带者、艾滋病病人血清中测出低水平的抗病毒中和抗体，其中艾滋病病人水平最低，HIV携带者最高，说明该抗体在体内有保护作用。但抗体不能与单核巨噬细胞内存留的病毒接触，且HIV囊膜蛋白易发生抗原性变异，原有抗体失去作用，使中和抗体不能发挥应有的作用。在潜伏感染阶段，HIV前病毒整合入宿主细胞基因组中，因此HIV不会被免疫系统所识别，所以单单依靠自身免疫功能无法将其清除。